中华皮肤科杂志 ›› 2023, Vol. 56 ›› Issue (12): 1123-1130.doi: 10.35541/cjd.20230326
李华平 高爱莉 梁碧华 邓蕙妍 陈教全 邹荟 林天一 张三泉 朱慧兰
Li Huaping, Gao Aili, Liang Bihua, Deng Huiyan, Chen Jiaoquan, Zou Hui, Lin Tianyi, Zhang Sanquan, Zhu Huilan
摘要: 【摘要】 目的 研究二甲双胍对长波紫外线(UVA)所致人永生化角质形成细胞系(HaCaT)光老化的影响及机制。方法 采用细胞计数(CCK8)法测定不同浓度(0 ~ 100 mmol/L)二甲双胍对HaCaT细胞活力的影响,选择10 mmol/L二甲双胍进行后续实验。将培养的HaCaT细胞分为空白对照组、二甲双胍组、UVA照射组和二甲双胍 + UVA组(用含10 mmol/L二甲双胍的培养基处理24 h后采用UVA照射细胞),其中UVA每天以10 J/cm2照射1次,连续照射3 d。共处理4 d后收集细胞,β半乳糖苷酶法测定各组衰老细胞比例,2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯法测定胞内活性氧(ROS)水平,彗星实验测定DNA损伤水平。另将培养的HaCaT细胞分为空白对照组、二甲双胍组、1.25 μmol/L多索吗啡(dorsomorphin) + 二甲双胍组、2.5 μmol/L dorsomorphin + 二甲双胍组,其中后两组分别采用1.25、2.5 μmol/L dorsomorphin处理细胞2 h后再用10 mmol/L二甲双胍处理24 h,Western印迹法检测核转录因子E2相关因子2(Nrf2)的细胞定位及磷酸化水平。使用小干扰RNA(siRNA)法将siRNA-Nrf2转染至HaCaT细胞以敲低Nrf2表达(siRNA-Nrf2组),对2.5 μmol/L dorsomorphin处理的HaCaT细胞以及Nrf2敲低的HaCaT细胞进行二甲双胍孵育和UVA照射(dorsomorphin + 二甲双胍 + UVA组、siRNA-Nrf2 + 二甲双胍 + UVA组),进一步分析各组衰老细胞比例。统计分析采用单因素方差分析及两因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。结果 不同浓度二甲双胍处理24 h可不同程度地影响HaCaT细胞活力(F = 5 206.31,P <0.001),其中10 ~ 20 mmol/L二甲双胍组细胞相对存活率与对照组(0 mmol/L二甲双胍组)相比差异无统计学意义(均P > 0.05),而25 ~ 100 mmol/L二甲双胍组细胞相对存活率显著低于对照组(均P < 0.05)。UVA照射后HaCaT细胞发生明显皱缩且变狭长,细胞间隙增大,UVA照射组细胞相对存活率(76.13% ± 1.03%)显著低于空白对照组(100.00% ± 1.24%,LSD-t = 14.86,P < 0.001),而二甲双胍 + UVA组细胞存活率(106.69% ± 2.45%)显著高于UVA照射组(LSD-t = 11.55,P < 0.001)。此外,UVA照射组衰老细胞比例(45.14% ± 4.98%)、胞内ROS水平(144.61% ± 4.91%)、细胞核尾部DNA百分比(75.33% ± 1.77%)均显著高于空白对照组(23.84% ± 1.89%、55.49% ± 1.57%、1.88% ± 0.29%,均P < 0.001),而二甲双胍 + UVA组衰老细胞比例(24.26% ± 1.34%)、胞内ROS水平(58.62% ± 2.17%)、细胞核尾部DNA百分比(15.83% ± 1.23%)均显著低于UVA照射组(均P < 0.001)。Western印迹结果显示,10 mmol/L二甲双胍组细胞质中Nrf2表达低于空白对照组,细胞核中磷酸化Nrf2表达高于空白对照组,二甲双胍可有效诱导Nrf2的磷酸化,并诱导其核转位;经dorsomorphin预处理后,1.25、2.5 μmol/L dorsomorphin均能明显降低10 mmol/L二甲双胍诱导的AMPKα和Nrf2磷酸化水平。dorsomorphin + 二甲双胍 + UVA组、siRNA-Nrf2 + 二甲双胍 + UVA组衰老细胞比例分别为67.84% ± 2.74%和65.94% ± 1.33%,均显著高于二甲双胍 + UVA组(37.76% ± 1.64%,t值分别为14.45、13.34,均P < 0.001)。结论 二甲双胍可能通过激活AMPK/Nrf2信号通路,清除ROS和减少DNA损伤,从而抑制UVA诱导的HaCaT细胞光老化。
李华平 高爱莉 梁碧华 邓蕙妍 陈教全 邹荟 林天一 张三泉 朱慧兰. 二甲双胍激活单磷酸腺苷活化蛋白激酶/核转录因子E2相关因子2信号通路抑制长波紫外线诱导的HaCaT细胞光老化[J]. 中华皮肤科杂志, 2023,56(12):1123-1130. doi:10.35541/cjd.20230326
Li Huaping, Gao Aili, Liang Bihua, Deng Huiyan, Chen Jiaoquan, Zou Hui, Lin Tianyi, Zhang Sanquan, Zhu Huilan. Metformin inhibits ultraviolet A-induced photoaging of HaCaT cells by activating the adenosine monophosphate-activated protein kinase/nuclear factor-erythroid 2-related factor 2 signaling pathway[J]. Chinese Journal of Dermatology, 2023, 56(12): 1123-1130.doi:10.35541/cjd.20230326