中华皮肤科杂志 ›› 2011, Vol. 44 ›› Issue (10): 712-716.
王志勇1,刘玲西安2,李春英3,坚哲4,李凯西安5,李强西安6,高天文3
摘要:
目的 探讨DJ-1蛋白在原代培养的人黑素细胞中的表达以及抵抗H2O2诱导的氧化应激作用。方法 免疫荧光方法鉴定DJ-1在原代培养黑素细胞中的表达;使用不同浓度H2O2处理黑素细胞24 h,改良MTT法选取适宜H2O2浓度为后续实验条件;Western印迹检测H2O2处理组细胞内DJ-1表达变化;采用反向转染方法,实验分为空白对照组(不含siRNA片段)、阴性对照组(转染非特异性siRNA)和实验组(转染DJ-1特异性siRNA)。光学显微镜观察细胞贴壁后形态学差异;改良MTT法、荧光探针2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)、膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(AnnexinⅤ-FITC/PI)分别检测H2O2处理后细胞活力变化、细胞内活性氧(ROS)水平及凋亡比例。结果 免疫荧光显示DJ-1在黑素细胞细胞核和胞质中均表达,以细胞核表达为主;细胞活力随H2O2浓度增高呈剂量依赖关系下降,与对照组比较,0.5 mmol/L H2O2处理24 h后,细胞活力开始下降(P < 0.05)。做诱导氧化应激的实验条件;Western印迹结果显示,0.5 mmol/L H2O2处理细胞24 h后,DJ-1表达增高为H2O2未处理组的2.23倍(P < 0.05)。干涉DJ-1表达后,实验组黑素细胞形态与空白对照组相比,树突减少缩短,胞质空泡化改变。使用0.5 mmol/L H2O2处理24 h后,siRNA-DJ-1组细胞活力为对照组的35%(P < 0.05)。细胞内ROS的荧光密度值(FI)值(902 ± 40)和凋亡比例(58% ± 6.1%)增高,与空白对照组细胞内ROS的FI值(529 ± 32)和凋亡比例(30% ± 3.8%)相比,P值均 < 0.05。结论 DJ-1在黑素细胞中能够通过降低细胞内ROS水平和抑制细胞凋亡,从而抵抗H2O2所诱导的氧化应激。