中华皮肤科杂志 ›› 2018, Vol. 51 ›› Issue (3): 177-181.doi: 10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2018.03.003
王小坡1,倪娜娜2,熊竞舒1,宋昊3,姜祎群4,陈浩4,曾学思4,孙建方4
1, 1, 1,Hao SongYi-Qun JIANG1, 1, 1,
摘要: 目的 构建人泛素连接酶Cbl-b基因短发卡RNA(shRNA)重组慢病毒载体,探讨其对人黑素瘤A375细胞生物学行为的影响。方法 设计并合成3条沉默Cbl-b 基因的特异性shRNA及1条阴性对照shRNA,构建慢病毒载体。将A375细胞分成5组,即分别用3条特异性shRNA转染的CBLB-shRNA-1组、CBLB-shRNA-2组、CBLB-shRNA-3组,阴性对照组(阴性对照shRNA转染),空白对照组(转染空载体)。应用实时荧光定量PCR和Western印迹检测转染后72 h各组A375细胞沉默效率;CCK8法检测转染后24、48、72及96 h细胞增殖能力;流式细胞仪检测转染后72 h细胞凋亡情况、细胞周期,Transwell法检测转染后72 h细胞侵袭能力。结果 成功构建3条Cbl-b shRNA慢病毒载体,Western印迹示CBLB-shRNA-3蛋白沉默效率最高。CCK8检测表明,CBLB-shRNA-3组A375细胞增殖能力在转染后72 h和96 h较阴性对照组、空白对照组明显降低(均P < 0.01)。流式细胞仪检测示,CBLB-shRNA-3组凋亡率[(22.73 ± 6.58)%]明显高于阴性对照组[(6.08 ± 1.35)%]和空白对照组[(6.34 ± 1.07)%,均P < 0.01]。CBLB-shRNA-3组G1期细胞比例明显高于阴性对照组和空白对照组(P < 0.01),而S期细胞比例明显低于阴性对照组和空白对照组(P < 0.01)。Transwell检测示,阴性对照组、空白对照组和CBLB-shRNA-3组转染后72 h时穿膜细胞数分别为76.60 ± 1.82、73.20 ± 3.83、19.60 ± 1.14,差异有统计学意义(F = 794.50,P < 0.01)。结论 成功构建能高效沉默Cbl-b蛋白的CBLB-shRNA-3重组shRNA慢病毒载体,其可促进A375细胞凋亡,抑制A375细胞增殖、细胞周期进程和侵袭能力。