中华皮肤科杂志 ›› 2017, Vol. 50 ›› Issue (2): 81-85.
杨佳1,李黎明1,许翠1,龙嘉2,3,杨雪源4,蒋明军4
jia YANG1, 1, 1,Jia Long2,3, Mingjun Jiang
摘要: 目的 探讨慢病毒携带的靶向人乳头瘤病毒16(HPV16)E7基因的短发夹干扰RNA(shRNA)对HPV16阳性宫颈癌SiHa细胞中4种甲基转移酶(DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L)表达水平的影响。方法 构建HPV16 E7基因靶序列的shRNA重组质粒,用BLOCK?iT? Lentiviral RNAi Expression System试剂盒进行慢病毒包装,分别转染293T细胞48、72 h后收集病毒上清液。分别用含靶向HPV16 E7?shRNA重组质粒的病毒上清液与完全培养基(1∶1)的混合液(shRNA组)、含空白质粒(即不含靶向HPV16 E7?shRNA序列)的病毒上清液与完全培养基(1∶1)的混合液(阴性对照组)、完全培养基(空白对照组)培养SiHa细胞。感染0、48、96 h后,用实时荧光定量PCR(qRT?PCR)检测3组SiHa细胞中HPV16 E7和4种甲基转移酶mRNA的表达,Western印迹检测4种甲基转移酶的蛋白表达。结果 感染0 h时,shRNA组、阴性对照组、空白对照组SiHa细胞HPV16 E7、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L mRNA相对表达量比较,差异无统计学意义(均P > 0.05);感染48、96 h时,3组细胞间HPV16 E7和4种DNMT mRNA相对表达量比较,差异有统计学意义(均P < 0.05)。shRNA组HPV16 E7、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L mRNA表达水平在48 h时的沉默效率分别为71.13%、50.53%、13.72%、46.27%和17.92%,96 h时分别为83.50%、74.2%、47.8%、64.7%和48.9%;而阴性对照组和空白对照组各时间点表达水平差异无统计学意义(均P > 0.05)。慢病毒感染48、96 h时,3组细胞间上述4种DNMT蛋白表达量差异有统计学意义(均P < 0.01)。shRNA组4种DNMT蛋白表达水平随感染时间的延长而逐渐下降,感染48 h时DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L蛋白表达抑制率分别为84%、37.2%、59.8%、49.3%,96 h时分别为73.1%、68.7%,55.5%、65.5%。结论 靶向沉默HPV16阳性宫颈癌SiHa细胞E7基因能够干扰DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L mRNA及蛋白的表达。
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