中华皮肤科杂志 ›› 2013, Vol. 46 ›› Issue (11): 815-819.

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血清饥饿处理对人角质形成细胞系HaCaT细胞自噬的调控效应研究

陈旭1,郭新云2,徐松1,张孟丽1,金慧3,邢美春4,黄丹5,任发亮6,杜开和4,鞠梅7,李新宇8,陈崑8,周之海3,顾恒1   

  1. 1. 中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所
    2. 山东省潍坊市皮肤病防治所
    3. 天津医科大学总医院皮肤科
    4. 南京师范大学生命科学学院
    5. 中国医学科学院皮肤病研究所理疗科
    6. 重庆医科大学附属儿童医院
    7. 南京 中国医学科学院北京协和医学院皮肤病医院
    8. 南京 中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所
  • 收稿日期:2012-08-08 修回日期:2013-09-29 出版日期:2013-11-15 发布日期:2013-11-01
  • 通讯作者: 顾恒 E-mail:guheng@aliyun.com
  • 基金资助:
    慢性紫外线损伤致皮肤成纤维细胞自噬发生的分子机制研究;中波紫外线对人角质形成细胞光损伤中的自噬研究;调控自噬药物的抗皮肤光老化效应的分子机制研究;中波紫外线对角质形成细胞Hedgehog通路影响的初步研究

Regulatory effect of serum starvation on autophagy in a human keratinocyte cell line HaCaT

  • Received:2012-08-08 Revised:2013-09-29 Online:2013-11-15 Published:2013-11-01

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摘要： 【摘要】 目的 研究血清饥饿处理对人角质形成细胞系HaCaT细胞自噬的调控效应，初步分析其分子机制。 方法 采用血清饥饿处理体外培养的HaCaT细胞诱导自噬，分析血清饥饿对细胞形态和细胞活力（MTT法）的影响。透射电镜观察自噬体囊泡形成，使用Western印迹法进行自噬标志性分子LC3-Ⅰ→LC3Ⅱ转化分析和自噬关键基因Atg7的表达以及MDC染色标记自噬体囊泡。对mTOR的蛋白表达及其ser2448和ser2481位点磷酸化产物水平进行分析。 结果 血清饥饿HaCaT细胞活力上升，电镜观察和MDC染色发现，血清饥饿处理的HaCaT细胞中有自噬体囊泡形成。Western印迹显示，血清饥饿细胞LC3-Ⅰ→LC3Ⅱ转化（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率为3.508 ± 0.415）较正常培养的细胞（0.538 ± 0.038）显著上调（两组比较，t = 13.32，P < 0.01）；自噬关键基因Atg7表达上调（对照细胞和血清饥饿细胞Atg7/GAPDH分别为0.021 ± 0.006和0.048 ± 0.011，t = 7.27，P < 0.05）。血清饥饿处理的细胞中，mTOR的ser2448位点、ser2481位点磷酸化产物水平显著降低（对照细胞和血清饥饿细胞间的磷酸化mTORser2448/mTOR比率分别为0.762 ± 0.108和0.394 ± 0.048，t = 7.58，P < 0.05；磷酸化mTORser2481/mTOR的比率分别为0.263 ± 0.039和0.111 ± 0.020，t = 13.77，P < 0.01）。 结论 血清饥饿处理可以诱导HaCaT细胞发生自噬，并且导致细胞活力上升。这种自噬的诱导可能与自噬调控关键元件mTOR蛋白活化抑制相关。 【关键词】 角蛋白细胞； 自噬； 细胞，培养的

关键词: 角蛋白细胞, 自噬, 细胞，培养的

Abstract: CHEN Xu*, GUO Xin-yun, XU Song, ZHANG Meng-li, JIN Hui, XING Mei-chun, HUANG Dan, REN Fa-liang, DU Kai-he, JU Mei, LI Xin-yu, CHEN Kun, ZHOU Zhi-hai, GU Heng. *Institute of Dermatology, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Nanjing 210042, China Corresponding authors: JU Mei, Email: jumeiweng@163.com; GU Heng, Email: guheng@aliyun.com 【Abstract】 Objective To evaluate the regulatory effect of serum starvation on autophagy in human HaCaT keratinocytes, and to investigate its molecular mechanism. Methods HaCaT cells were cultured either in Dulbecco′s modified Eagle′s medium （DMEM） + 10% fetal calf serum （control group） or in DMEM without fetal calf serum （starvation group）, for four hours. Then, cell appearance was observed by light microscopy, methyl thiazolyl tetrazolium （MTT） assay was performed to evaluate cell viability, transmission electron microscopy to observe ultrastructural changes, monodansylcadaverine （MDC） staining to identify the formation of autophagosomes, and Western blot to measure the expression of microtubule-associated protein 1 light chain 3 （LC3）-Ⅱ, LC3-Ⅰand autophagy related protein 7 （ATG7）. Additionally, the phosphorylation level of mammalian target of rapamycin （mTOR） at Ser2448 and Ser2481 was semiquantitatively analyzed by Western blot. Results Serum starvation increased the viability of HaCaT cells. Electron microscopy and MDC staining confirmed the formation of autophagosomes in serum-starved HaCaT cells. Compared with the control cells, the serum-starved HaCaT cells showed a significant increase in the transformation of LC3-Ⅰto LC3-Ⅱ （LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰratio: 3.508 ± 0.415 vs. 0.538 ± 0.038, t = 13.32, P < 0.01）, and expression of ATG7 （ATG7/GAPDH ratio: 0.048 ± 0.011 vs. 0.021 ± 0.006, t = 7.27, P < 0.05）. The phosphorylation level of mTOR at ser2448 and ser2481 was significantly lower in the serum-starved HaCaT cells than in the control cells （phosphorylated mTOR（ser2448）/mTOR ratio: 0.394 ± 0.048 vs. 0.762 ± 0.108, t = 7.58, P < 0.05; phosphorylated mTOR （ser2481）/mTOR ratio: 0.111 ± 0.020 vs. 0.263 ± 0.039, t = 13.77, P < 0.05）. Conclusion Serum starvation can induce autophagy in and increase the viability of HaCaT cells, likely by inhibiting the activation of mTOR. 【Key words】 Keratinocytes; Autophagy; Cells, cultured