中华皮肤科杂志 ›› 2012, Vol. 45 ›› Issue (7): 496-500.
陈旭1,张青松2,鞠梅3,任发亮4,黄丹5,齐蓓3,陈崑3,常宝珠3,李新宇顾恒6
摘要:
目的 探讨不同剂量中波紫外线(UVB)照射人皮肤成纤维细胞诱导的自噬对细胞凋亡活性的影响。方法 人皮肤成纤维细胞来自于23岁健康男性环切术后包皮的原代培养,连续传代培养后取第3 ~ 10代的细胞进行实验。通过单丹酰戊二胺(MDC)染色和免疫荧光标记微管相关蛋白1轻链3(LC3)的方法,确定不同剂量3-甲基腺嘌呤(3-MA)对自噬的抑制作用。UVB照射后立即加入0.5 mmol/L 3-MA孵育细胞4 h作为自噬的抑制方法。Hoechst和碘化丙啶(PI)染色结合Annexin Ⅴ-异硫氰酸荧光素(FITC)和PI标记细胞后流式细胞仪检测作为细胞凋亡的定性和定量方法。 结果 0.5 mmol/L 3-MA能明显抑制人皮肤成纤维细胞自噬活性(饥饿诱导组自噬细胞阳性百分数为63.037% ± 5.876%,3-MA孵育后下降至34.425% ± 5.183%)。空白对照组、30、50、100 mJ/cm2 UVB照射组标记LC3绿色荧光信号逐渐增强,照射后立即对上述4组加入3-MA孵育4 h则LC3蛋白表达差异不明显。0.5 mmol/L 3-MA对细胞活性影响最小。50 mJ/cm2 UVB照射下加入3-MA孵育较未加3-MA孵育细胞强Hoechst和强PI双染细胞增多;100 mJ/cm2 UVB照射后加3-MA孵育较未加3-MA孵育细胞强Hoechst和强PI双染细胞减少。Annexin Ⅴ-FITC和PI标记细胞后流式细胞仪分析显示,在50 mJ/cm2 UVB照射下,抑制自噬的细胞中晚期凋亡水平[(10.933 ± 0.839)%]较未抑制细胞[(7.267 ± 0.473)%]上升,两者之间差异具有统计学意义(t = 5.20,P < 0.05);而在100 mJ/cm2 UVB照射下,抑制自噬的细胞中晚期凋亡水平[(7.100 ± 0.781)%]较未抑制细胞[(10.133 ± 0.681)%]下降,两者之间差异具有统计学意义(t = 6.29,P < 0.05)。结论 50 mJ/cm2 UVB照射诱导人皮肤成纤维细胞自噬通过抑制凋亡对细胞起到保护作用,而在100 mJ/cm2 UVB照射下发生的较高水平自噬可能诱导了自噬性细胞死亡。