中华皮肤科杂志 ›› 2017, Vol. 50 ›› Issue (10): 706-709.doi: 10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.10.003
粟倩雅 林彤 张孟丽 彭霖
Su Qianya, Lin Tong, Zhang Mengli, Peng Lin
摘要: 目的 优化Wnt5A特异性siRNA转染原代人黑素细胞的实验条件,建立沉默Wnt5A基因的模型。方法 培养原代人黑素细胞,将不同浓度(0、20.0、33.3、40.0、60.0 nmol/L)的阳性参照基因GAPDH特异性siRNA通过脂质体法介导转染原代人黑素细胞,实时荧光定量PCR(qPCR)筛选转染效率最高的siRNA浓度;合成3条Wnt5A?siRNA(Wnt5A?siRNA?793、Wnt5A?siRNA?943、Wnt5A?siRNA?1743),分别转染原代人表皮黑素细胞,qPCR法选择干扰特异性最佳的Wnt5A?siRNA;用最佳Wnt5A?siRNA转染原代人黑素细胞,分别于培养24、48、72 h提取总mRNA及总蛋白,通过qPCR及Western印迹法确定转染效率最高的时间点。结果 0、20.0、33.3、40.0、60.0 nmol/L GAPDH?siRNA转染原代人黑素细胞后,GAPDH mRNA相对表达量分别为1.009 ± 0.161、0.086 ± 0.010、0.140 ± 0.016、0.285 ± 0.095、0.012 ± 0.007,组间比较,差异有统计学意义(F = 69.469,P < 0.05)。60 nmol/L siRNA组GAPDH表达低于其他各组(均P < 0.05),干扰效率最佳;各Wnt5A?siRNA组及空白组Wnt5A mRNA相对表达量分别为0.331 ± 0.010、2.229 ± 0.029、0.078 ± 0.006、1.000 ± 0.024,差异有统计学意义(F = 7 006.094,P < 0.05)。Wnt5A?siRNA?1743组目标分子表达量低于其他3组(均P < 0.05),干扰效率最佳。Wnt5A?siRNA?1743转染原代人表皮黑素细胞后24、48、72 h及空白组 Wnt5A mRNA相对表达量分别为0.396 ± 0.002、0.026 ± 0.008、0.131 ± 0.079、1.025 ± 0.276,组间比较,差异有统计学意义(F = 29.215,P <0.05),干扰后48 h低于干扰后24、72 h及空白组(均P < 0.05);Wnt5A蛋白相对表达量分别为112.798 ± 0.218、77.765 ± 0.415、30.540 ± 0.219、130.025 ± 0.158,组间比较,差异有统计学意义(F = 79 122.889,P < 0.05),干扰后72 h低于干扰后24、48 h及空白组(均P < 0.05)。结论 成功建立siRNA沉默人黑素细胞Wnt5A基因的模型。
粟倩雅 林彤 张孟丽 彭霖. 原代人黑素细胞Wnt5A基因沉默的研究[J]. 中华皮肤科杂志, 2017,50(10):706-709. doi:10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.10.003
Su Qianya, Lin Tong, Zhang Mengli, Peng Lin. Wnt5A gene silencing in primary human melanocytes[J]. Chinese Journal of Dermatology, 2017, 50(10): 706-709.doi:10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.10.003